Massimo Ambrosini zawodową karierę rozpoczynał w drużynie AC Cesena. Jej barwy reprezentował w sezonie 1994/1995, w którym pojawił się w 25 ligowych spotkaniach. Następnie podpisał kontrakt z A.C. Milan. W nowym klubie zadebiutował 30 sierpnia 1995 roku w wygranym 4:1 wyjazdowym pojedynku z Pescara Calcio. Sezon 1997/1998 Ambrosini spędził na wypożyczeniu w innym włoskim zespole - Vicenza Calcio, dla której rozegrał 27 meczów. Po powrocie na San Siro zaczął grywać regularnie. Z Milanem Ambrosini dwa razy wygrywał Ligę Mistrzów oraz Superpuchary Europy. W kraju trzykrotnie zdobył mistrzostwo Włoch, a także zdobył puchar i superpuchar kraju. Massimo dla ekipy "Rossonericg" rozegrał już ponad 200 spotkań. Obecnie jest vice-kapitanem włoskiego zespołu, jednak po zakończeniu piłkarskiej kariery przez Paolo Maldiniego wychowanek Ceseny przejmie opaskę kapitańską już na stałe.